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干货分享 | 细胞蛋白质的提取

浏览数量： 0 作者：本站编辑发布时间： 2024-07-15 来源：本站

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提取蛋白质是做好WB实验的第一步，为保证蛋白质的质量和稳定性，提取过程中需全程保持低温，并提前预冷离心机及装蛋白质的离心管。

1、细胞铺板

使用6cm小皿进行细胞铺板，盖和底部都需做好标记，用“∞”法将细胞摇匀。待细胞密度达到90%时收样。

建议使用爱津6cm细胞培养皿，经TC处理后，细胞贴壁效果良好。

2、收样

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长成这样就差不多了

弃去旧的培养基，使用PBS洗涤两次（此时细胞仍为活细胞，无预冷PBS），用枪头吸干残余液体，将培养皿置于冰上预冷。若细胞生长速度不同，可以先将样品放在-80℃，待所有样品收集完毕后再进行提取。

3、裂解

冰上裂解15min

向6cm小皿中加入120μL裂解液（可直接使用无添加PMSF的裂解液，若使用RIPA裂解液则需按100：1加入PMSF，现配现用）。轻轻晃动小皿使裂解液均匀分布，冰上裂解15分钟。在裂解期间，标记好1.5mL离心管并插置于冰上预冷，同时将离心机预冷至4℃。准备好细胞刮（建议选择刮头较宽的细胞刮刀，刮取效率更高）。

标记好1.5ml离心管并置于冰上预冷

4、刮蛋白

使用细胞刮将蛋白刮下，刮到边缘，用枪吸取转移至预冷好的1.5mL离心管中。刮蛋白时在培养皿下垫一块冰砖以保持低温。

5、超声

一般进行3-5次超声，超声过程中会产生热量，因此超声完毕后需立即将离心管插入冰上或放入冰盒中降温。如果没有超声机，可以使用涡旋混匀仪混匀60秒。

6、离心去上清

4℃，12000g离心6分钟，将上清液转移至预冷好的全新离心管中。

7、蛋白定量与上样

使用BCA方法测定蛋白浓度，计算上样体积，一般上样量为30μg。

8、煮样

按4:1比例加入5×Loading Buffer，涡旋充分混匀。金属浴100℃煮5分钟，煮完后立即置于冰上冷却。

9、保存

如果不立即使用，样品应及时保存在-20℃环境下。

蛋白质提取是确保实验成功的关键，严格保持低温、选择合适的实验器材、规范操作，每一步都非常重要。建议使用爱津6cm细胞培养皿，产品经严格质量控制，能有效提高蛋白质的质量和稳定性，为后续实验提供可靠基础。选择合规产品，让实验更高效、更顺利！

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